Представленные работы выполнены в течение последних трех лет и посвящены использованию импульсной ЭПР спектроскопии для изучения промежуточных парамагнитных состояний убихинона (UQ) и Риске (Rieske) кластера в двух каталитических центрах bc₁ комплекса. Цель работы - обнаружение специфического взаимодействия с протеином, влияющее на свойства хинона и Риске кластера и регулирующее каталитическую активность фермента. Работы выполнены в сотрудничестве с Лабораториями Факультета Биохимии Университета штата Иллинойс в Урбана-Шампень, Факультета Биохимии Токийского Университета и Факультета Естественных наук Университета г. Осака. Биохимические и молекулярно генетические работы по выделению ферментов, их очистке, инкорпорированию изотопных меток проведены нашими коллегами и поддержаны грантами NIH, NSF и Japan MEXT. FIRCA грант (Foggarty International Center NIH) и NATO были сфокусированы на поддержке работ по импульсной спектроскопии ЭПР для российских участников.

Мультиферментный bc₁ комплекс (убихинол : цитохром с-оксидоредуктаза) катализирует перенос электрона от восстановленного убихинона (фактически от убихинола) к цитохрому b и с. Предполагается, что убихинон окисляется в двух последовательных реакциях, которые осуществляются в так называемых центрах Q_i и Q_о, локализованных на противоположных сторонах мембраны. В состав комплекса входят следующие кофакторы (не белковые молекулы): цитохромы b (две формы, b₅₆₆ и b_562, отличающиеся спектрами поглощения, ЭПР сигналами и редокс-потенциалами), цитохром c, железосерный кластер Риске [2Fe-2S] и убихиноны.

Первые две работы [1,2] представляют результаты по исследованию радикала убихинона в востановительном Q_i центре bc₁ комплекса, выделенного из Rhodobacter sphaeroides. Частотный анализ модуляции в спаде сигнала ЭСЭ и анализ двумерных HYSCORE спектров радикала семихинона указывает на присутствие ядер азота в лигандном окружении. Электрон-ядерное взаимодействие с характерной константой ~0.8 MHz обусловлено образованием водородной связи между радикалом убихинона и имидазолиновым азотом His-217, находящемся на расстоянии 2.5-3.1  от карбонильной С-О группы хинона. Этому подвижному лиганду отводится важная динамическая роль в переносе протона в этом месте. Используя дейтерозамещение, удалось выявить три обменивающихся группы протонов вблизи радикала убихинона, стабилизированного в Q_i центре, отличающихся величиной изотропной и анизотропной частей константы СТВ. Величины констант свидетельствуют о принадлежности их водородно связанным протонам из ближайшего протеинового окружения. В отличие от водородных связей, анализированных ранее в модельных экспериментах, для радикала, стабилизированного в замороженных растворах, протеиновые водородные связи значительно выходят из плоскости ароматического кольца молекулы убихинона. Используя имеющиеся кристаллографические данные, две группы протонов отнесены к боковым цепям His-217 и Asp-252 а третья, с маленькой величиной константы СТВ, обусловлена водородной связью кислорода метокси-групп с водой или близлежащим Asn-221. Эта сетка из водородных связей удерживает радикал убихинона в соотвтствующей ориентации для эффективного переноса электрона и протона. На основе этих данных была предложена механистическая модель Q_i центра.

В работах [3,4] изучалось взаимодействие Риске кластера с субстратом, находящемся в окислительном Qo-центре bc₁ комплекса из Rhodobacter sphaeroides. Ориентация кластера и образование комплекса между железосерным белком и субстратом является лимитирующей стадией реакции переноса электрона на окислительном центре. Достоверно установлено, что редокс свойства и параметры g-тензора в спектрах ЭПР Риске кластера меняются в зависимости от того, какое вещество находится в Q_о центре, который в нативном белке свободен или занят убихиноном. Наиболее широко используемыми субстратами, замещающими убихинон в Q_о центре, являются два лекарственных препарата, стигмателин и миксотиазол. Предполагается, что стигмателин, также как и убихинон, образует водородную связь через карбонильный фрагмент с N_e азотом гистидиновых лигандов Риске кластера, удерживая его в ориентации наиболее эффективной для электронного переноса. При этом спиновая плотность и константа на N_b азоте гистидина зависит от прочности и направленности водородной связи между N_e азотом и молекулой субстрата. Используя ESEEM, в работе [3] проведен анализ сверхтонкого взаимодействия ядер азота ¹⁴N_b для убихинона, стигмателина или миксотиазола в Q_о центре. Обнаружено существенное отличие величины изотропной константы СТВ и параметров квадрупольного взаимодействия на азоте N_b гистидина в присутствии миксотиазола по сравнению с убихиноном и стигмателином. Эта разница объяснена наличием или отсутствием водородной связи между гистидином Риске и субстратом.

В двух последних работах [5,6] ЭСЭ спектроскопия применена для анализа структурных факторов, влияющих на окислительные свойства Риске кластера в двух протеинах, выделеных из гипертермофильных архебактерий и отличающихся редокс потенциалами. Протеин с потенциалом ~ +190 mV, (high-potential sulfredoxin или SDX) выделен из бактерий Sulfolobus Tokadaii, с потенциалом ~ -90 mV (low-potential arhaeal feredoxin или ARF) выделен из Sulfolobus solfotaricus. ¹⁴N ЕSEEM и HYSCORE спектры существенно отличны для SDX и ARF из-за отличий в координационной геометрии гистидиновых лигандов Риске. Впервые показано, что параметры тензора квадрупольного взаимодействия ядер азота гистидина более чувствительны к изменению геометрии лигандов чем параметры тензора СТВ. Эта особенность может быть использована для сравнительной характеристики Риске кластеров в различных бактериях и мутантах.

В работе [6], с использованием изотопного замещения на ¹⁵N в Риске кластере SDX, впервые получены доказательства участия в водородной связи двух обменивающихся ядер азота,: N_e азот гистидина и пептидного ¹⁵N_p азота.

Экспериментальная часть работы по ЭСЭ спектроскопии выполнена на спектрометре фирмы Брукер в Университете штата Иллинойс в Урбана-Шампень, в связи с необходимостью использования жидкого гелия для регистрации сигнала в образцах bc₁ комплекса. Обработка данных проводилась в Новосибирске и в Урбана-Шампень.

1. D.R.J. Kolling, R.I. Samoilova, J.T. Holland, E.A. Berry, S.A. Dikanov and A.R. Crofts

Exploration of Ligands to the Q_i site Semiquinone in the bc₁ Complex Using High-resolution EPR. Journ. Biol. Chem. 2003, V. 278, p 39747-39754

2. S.A. Dikanov, R.I. Samoilova, D.R.J. Kolling, J.T. Holland and A.R. Crofts

Hydrogen Bonds Involved in Binding the Q_i –site Semiquinone in the bc₁ Complex, Identified through Deuterium Exchange Using Pulse EPR. Journ. Biol. Chem. 2004, V. 279, p 15814-15823.

3. R.I. Samoilova, D.R.J. Kolling, Taketoshi Uzawa, Toshio Iwasaki, A.R. Crofts and S.A. Dikanov.
The interaction of Rieske Iron-Sulfur Protein with Occupants of the Q_o -site
of the bc₁ Complex, probed by Electron Spin Echo Envelope Modulation. Journ. Biol. Chem.2002, V. 277, p. 4605-4608.

4. A.R. Crofts,V.P. Shinkarev, S.A. Dikanov, R.I. Samoilova, D.R.J. Kolling.
Interactions of quinone with iron-sulfur protein of the bc₁ complex: Is the mechanism spring-loaded? BBA 2002, V.1555, p.48-53.

5. S.A. Dikanov, A.A. Shubin. Asako Kounosu, Toshio Iwasaki, R.I. Samoilova.
A comparative, two-dimensional ¹⁴N ESEEM characterization of reduced [2Fe-2S] cluster in hyperthermophilic archaeal high- and low-potential Rieske-type proteins. J. Biol. Inorg. Chem. 2004, V.9, p.753-767.

6. Toshio Iwasaki, Asako Kounosu, R.I. Samoilova, S.A. Dikanov.
Orientation-selected ¹⁵N HYSCORE detection of weakly coupled nitrogens around the archaeal Rieske [2F-2S] center. JACS 2004, V. 126, p. 13902-13903.