Генерация орто-семихинонов, супероксидного радикала и перекиси водорода
в процессе иммунного ответа насекомых

И.А. Слепнева, Д.А. Комаров, В.В. Храмцов (ИХКиГ СО РАН),

В.В. Глупов (ИСиЭЖ СО РАН)

Аннотация

Актуальность исследования.

Иммунная система насекомых состоит из целого ряда составляющих её механизмов и элементов. Среди них процесс меланизации с последующей инкапсуляцией патогенного организма является основным в иммунном ответе насекомых. Ключевой фермент меланизации, фенолоксидаза, окисляет орто-дифенолы (в частности, 3, 4-диоксифенилаланин, ДОФА) до орто-хинонов, которые, полимеризуясь, образуют меланиновую капсулу вокруг проникшего патогена. С другой стороны, предполагается [Rev Chem Intermediat, 1988; Science, 1973], что в результате одноэлектронного восстановления хинонов в биологических системах могут образовываться высоко реакционные орто-семихинонные радикалы (ДОФА-семихинон при меланизации), которые, в свою очередь, восстанавливают молекулярный кислород, давая супероксидный радикал (O2•). Орто-семихиноны и O2• можно рассматривать как возможные цитотоксичные молекулы в иммунном ответе насекомых. Однако исследования в этой области ограничиваются единичными работами, и до настоящего времени образование ДОФА-семихинона и O2• в гемолимфе насекомых напрямую не было зарегистрировано.

Новизна используемого подхода.

В ряде работ с помощью метода, основанного на восстановлении нитросинего тетразолия, тестировали генерацию O2• в гемолимфе насекомых [J Insects Physiol 1994, BioEssays 2000 и др.]. Однако неспецифичность данного метода не позволяет считать достоверными доказательства образования O2• в организме насекомых. Поэтому в данной работе была поставлена цель: исследовать образование ДОФА-семихинонов и O2• в процессе меланизации методом ЭПР и выяснить возможную роль этих частиц в иммунном ответе насекомых.

Полученные результаты и их значимость.

Зарегистрировано образование ДОФА-семихинона в гемолимфе насекомых методом спиновой стабилизации орто-семихинонов ионами Mg2+ [2]. Для регистрации O2• впервые для этой системы использовали спиновые ловушки (ДЭФМПО, ТАМ, СР-Н). Показали невозможность с их помощью зарегистрировать O2• вследствие обнаруженной способности ДОФА взаимодействовать с O2•. Исследовано это взаимодействие: определена константа скорости и показано, что продуктами окисления ДОФА супероксидным радикалом являются ДОФА-семихинон и перекись водорода. Величина константы этой реакции на порядки превышает величины констант скоростей для спиновых ловушек. По результатам ингибирования супероксиддисмутазой образования Н2О2 в процессе меланизации сделан вывод о возможной генерации супероксидного радикала [1,5,6]. Однако, в отличие от существующего мнения (Eur J Cell Biol 1995, Exp Parasitol 2001, J Parasitol 2002), в качестве основного цитотоксичного агента в защитном механизме насекомых мы рассматриваем такие реакционные интермедиаты меланизации как орто – хиноны/семихиноны (в частности, производные ДОФА) и перекись водорода, что было подтверждено в экспериментах на насекомых с применением различных патогенов [2-4].

Уровень полученных результатов в сравнении с мировым

Работа поддержана грантами РФФИ и СО РАН, докладывалась на международных конференциях:

  1. 3rd International Conference on Nitroxide Radicals // Kaiserslautern, Germany, 2001, стендовый.
  2. VI Voevodsky conference. Physics and chemistry of elementary chemical processes // Novosibirsk, 2002 - стендовый.
  3. Modern development of magnetic resonance // Kazan, 2004, - устный.
  4. The International Conference on Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy and Imaging of Biological Systems, Columbus, Ohio, USA, - стендовый.
  5. 4th International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides (SPIN-2005), 2005, Novosibirsk, - стендовый.
Список прилагаемых статей:
  1. Глупов В.В., Слепнёва И.А.

    2. Механизмы цитотоксичности. В книге: “Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты”. Издательство “Круглый год”, Москва, стр. 497-509, (2001).
  2. Irina A. Slepneva, Denis A. Komarov, Viktor V. Glupov, Valery V. Serebrov, Valery V. Khramtsov.

    3. Influence of fungal infection on the DOPA-semiquinone and DOPA-quinone production in haemolymph of Galleria mellonella larvae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300, 188-191, (2003).
  3. Viktor V. Glupov, Irina A. Slepneva, Valery V. Serebrov, Marina F. Khvoschevskay, Vyacheslav V. Martem’yanov., Ivan M. Dubovskiy.

    4. Influence of the fungal infection on the production of reactive metabolites and antioxidant state in hemolymph of Galleria mellonella larvae. Russian Entomological Journal, 12(1), 103-108, (2003).
  4. Lozinskaya YL, Slepneva IA, Khramtsov VV, Glupov VV.

    5. Changes of the antioxidant status and system of generation of free radicals in hemolymph of Galleria mellonella larvae at microsporidiosis, J. Evolut.Biochem.Physiol.,(Rus) 40 (2), 119-125, (2004).
  5. Denis A. Komarov, Irina A. Slepneva, Viktor V. Glupov, and Valery V. Khramtsov.

    6. Superoxide and hydrogen peroxide formation during enzymatic oxidation of DOPA by phenoloxidase. Free Radical Research, 39 (8), 853-858, (2005).
  6. Denis A. Komarov, Irina A. Slepneva, Viktor V. Glupov, and Valery V. Khramtsov.

    7. Detection of free radicals formation in haemolymph of insects by EPR spectroscopy. Apply Magnetic Resonance, 28, 411-419, (2005).