Спиновая химия пероксидазы хрена

Тарабан М.Б, Афанасьева М.С., Пуртов П.А., Н.Э. Поляков, Лёшина Т.В.,
Гриссом Ч.Б.*
*Университет Юты, Солт–Лейк – Сити, США

     Работа выполнена в области исследования элементарных механизмов сложных биохимических процессов физическими методами, и, конкретно, касается изучения стадий одноэлектронного переноса в ферментативном окислении органических субстратов пероксидазой хрена. Актуальность проблемы установления механизмов ферментативных превращений пероксидазы хрена обусловлена тем, что пероксидаза относится к семейству ферментов оксигеназ, которые, как известно, катализируют радикальные превращения.

     Проблема в том, что в настоящее время радикальные частицы считаются причинами наиболее распространенных болезней (атеросклероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона, раковые опухоли, сахарный диабет, и др.). Поэтому к исследованиям путей возникновения и гибели парамагнитных частиц, в частности активных кислородсодержащих форм в живых системах, привлечено повышенное внимание ученых разных специальностей. Кроме того, активные интермедиаты пероксидазы являются хорошими моделями для исследования отдельных стадий функционирования других оксигеназ, например, такого важного фермента, как цитохром Р-450.

     Что касается основного субстрата, окисление которого пероксидазой изучается в данном цикле работ, –то, это участвующий во многих процессах в живых системах, распространенный кофактор - НАДН. Роль одноэлектронных стадий в реакциях с его участием до сих пор широко дискутируется в мировой литературе. Отметим, что получение доказательств участия одноэлектронных стадий в окислении НАДН, а также установление магниточувствительности процесса имеет не только фундаментальное, но и практическое значение. В частности, установление самого факта влияния спиновых состояний парамагнитных форм реагентов на процессы в каталитических циклах ферментов, несомненно, будет полезно при непрекращающихся обсуждениях влияния магнитных полей на живые организмы.

     Использованный в работе подход состоит в изучении магнитных эффектов в процессах ферментативного окисления НАДН , а также его синтетического аналога 1,4 дигидропиридина (нифедипин), и эффектов ХПЯ при фотоинициируемом взаимодействии НАДН с пероксидазой хрена. Экспериментальные полевые зависимости магнитных эффектов, измеренных для отдельных стадий каталитического цикла, сравниваются с рассчитанными теоретически. Именно на основании результатов сопоставлении экспериментальных полевых зависимостей магнитных эффектов с рассчитанными для предполагаемой пары парамагнитных частиц и делается вывод о первой стадии каталитического цикла. Это - одноэлектронный перенос между нативной пероксидазой и НАДН.

     Подход разработан в лабораториях магнитных явлений и теоретической химии ИХКГ и является полностью оригинальным. Ключевое место в реализованном подходе принадлежит разработке методики расчета полевых зависимостей магнитных эффектов в многоспиновых системах, которая потребовала значительной модернизации ряда положений существующей теории радикальных пар.

    Скорость генерации и дальнейших трансформаций активных интермедиатов, входящих в состав каталитического цикла пероксидазы в различных магнитных полях, измерялась с помощью спектрофотометра остановленной струи. В результате анализа магнитных и спиновых эффектов, зарегистрированных при окислении НАДН и нифедипина, катализируемых пероксидазой хрена, предложен новый механизм окисления в отсутствии перекиси водорода. От литературного этот механизм отличается прежде всего первой стадией, которая представляет собой перенос электрона между нативной пероксидазой и НАДН, а не взаимодействие пероксидазы с перекисью, полученной при автоокислении субстрата. Анализ магнитных эффектов также позволил выявить зависимость скоростей взаимного превращения парамагнитных интермедиатов каталитического цикла HRP от их спинового состояния

     В присутствующем в цикле обзоре рассмотрены магнитные и спиновые эффекты, зарегистрированные в процессах окисления органических соединений, катализируемых пероксидазой хрена, как настоящим авторским коллективом, так и взятые из литературы. В обзоре впервые сформулированы правила отбора, которые приводят к проявлению магнитных и спиновых эффектов в ферментативных процессах, и суммированы основные условия, необходимые для их наблюдения в реакциях других ферментов.

     Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (No 04-03-32277), CRDF (No RC2-2390-NO-02, No RC2-2390-NO-02 (proposal 13241)), а также стипендии МБНФ им. К.И. Замараева (М.С. Афанасьева).

(Вклад авторского коллектива из ИХКГ составляет более 90%).
Результаты опубликованы в статьях.
  1. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B. Magnetic Spin Effects in Enzymatic Reactions: Radical Oxidation of NADH by Horseradish Peroxidase // J. Am. Chem. Soc., 128, 8651-8658 (2006).
  2. Afanasyeva M.S., Taraban M.B., Polyakov N.E., Purtov P.A., Leshina T.V., Grissom C.B. Elementary Steps of Enzymatic Oxidation of Nifedipine Catalyzed by Horseradish Peroxidase // J. Phys. Chem. B., 110, 21232-21237 (2006).
  3. Афанасьева М.С., Пуртов П.А., Тарабан М.Б., Лешина Т.В., Гриссом Ч.Б. Исследование фотоокисления NADH, катализируемого пероксидазой из хрена, методом химической поляризации ядер // Известия Академии наук, Сер. хим., 7, 1090-1095 (2006).
  4. Афанасьева М.С,. Пуртов П.А,. Тарабан М.Б, Лёшина Т.В. Спиновая химия ферментативных процессов, Успехи химии, 76, 651-668 (2007).