1. Общая формулировка научной проблемы и ее актуальность.
Направление переноса электрона и водорода в процессах фотосинтеза и дыхания регулируется в большинстве случаев хинонами, которые расположены и действуют в мембранах, входя в состав липидных белков. Двуэлектронная redox система хинона синхронизуется с одноэлектронной redox химией других участников процесса, таких как цитохромы, железо и медь содержащие комплексы. Детали функционирования хинонов значительно различаются, поскольку центры, стабилизирующие хиноны, в ходе эволюции претерпевали значительные изменения, подстраиваясь под различные электронные акцепторы и доноры с широким спектром потенциалов. Интерфейсы, через которые осуществляются окислительно-восстановительные реакции в каталитическом центре, определяются белковым окружением хинона и существенно отличаются друг от друга. Так что каждый хинон в определенном центре выполняет свою физиологическую роль.
2. Конкретная решаемая в работе задача и ее значение.
Современные методы молекулярной биологии позволяют успешно модифицировать структуру ферментов и т.о. продвинуться в понимании механизма функционирования хинонов в отдельных центрах. Наша работа сфокусирована на использовании высокоразрешающей спектроскопии ЭПР для определения структуры протеинового окружения и его влияния на функционирования хинона в комплексе цитохром-bo3 убихинол оксидазы из E-coli.
Фермент содержит два хинон-функционирующих центра, слабо связанный (QL) и сильно связанный (QH), и три redox активных металл содержащих кофактора: низкоспиновый цитохром сyt b и биядерный кластер высокоспинового цитохрома cyt o в комплексе с медью CuB. Комплекс этот находится в бактериальной плазматической мембране и катализирует двуэлектронное окисление убихинола-8 и 4 электронное восстановление кислорода до воды. В отличии от точных данных о расположении металл содержащих кофакторов расположение хинона по рентгеноструктурным данным установить не удается.
3. Используемые подходы, новизна и оригинальность.
В данном случае полезным оказалось применение импульсных методов ЭПР спектроскопии, таких как. ESEEM (electron spin echo envelop modulation), HYSCORE (hyperfine sublevel correlation), ENDOR (electron-nuclear double resonance). Для определения влияния аминокислотных фрагментов на функционирование убихинона в каталитическом (QH) центре проведен сайт направленный синтез мутантов с замещением аминокислот в ближайшем окружении хинона в (QH) центре [2], мутант D75H (аспарагиновая кислота замещена на гистидин) и D75E ( в котором аспарагиновая кислота замещена на глутаминовую).
4. Полученные результаты и их значимость.
Чтобы зафиксировать интермедиаты хинонов, проводилось частичное одноэлектронное восстановление bo3 комплекса в анаэробных условиях.
В работе[1] показано, что в ходе такого одноэлектронного превращения, в (QH) центре стабилизируется нейтральные радикалы убихинона, взаимодействующие с протеиновым окружением посредством двух сильных водородных связей с аминокислотными фрагментами. На основе этих данных определено что карбонильные фрагменты радикала убихинона в центре (QH) связаны с азотсодержащей группой Arg (R 71) или NH2 группой Gln (Q 101)и карбонильному фрагменту Asp (D75) .
Для определения влияния этих аминокислотных фрагментов на функционирование убихинона в каталитическом (QH) центре проведен сайт направленный синтез мутантов с замещением аминокислот в ближайшем окружении хинона в (QH) центре [2], мутант D75H (аспарагиновая кислота замещена на гистидин) и D75E ( в котором аспарагиновая кислота замещена на глутаминовую). Замещение аспарагиновой кислоты на гистидин в комплексе, приводит к почти полной потере активности фермента. При этом в качестве интермедиата стабилизируется анион-радикал убихинона. При замещении аспарагиновой кислоты на глутаминовую поведение комплекса не отличается от природного.
В работе [3], [4] приведены результаты и полный анализ модуляции после селективного замещения азота 14N в молекулах Arg (селективно заменены на 15N Nη, Nε и пептидный азоты в молекуле аргинина R 71), Gln (селективно заменены на 15N азоты в боковой цепи глутамина Q 101 ) и His98 для однозначного определения координирующих хинон лигандов в QH-центре bo3 комплекса.
5. Вклад авторского коллектива.
Инициатор биохимической части проекта и основной руководитель Robert B. Gennis Department of Biochemistry University of Illinois, Urbana, IL 61820.
Исполнители:
- Lai Lai Yap, Department of Biochemistry University of Illinois, Urbana, IL 61820;
- Myat T. Lin, Department of Biphysics University of Illinois, Urbana, IL 61820;
- Ouyang H., Department of Biphysics University of Illinois, Urbana, IL 61820; ( выращивание бактерий и ауксотрофов, выделение и анализ bo3 убихинол оксидазы, синтез мутантов с селективным замещением аминокислот и изотопное замещение, приготовление образцов для ЭПР спектроскопии).
Инициатор спектроскопической части проекта и основной руководитель Sergei A. Dikanov , Veterinary Clinical Medicine, University of Illinois, Urbana, IL 61820.
Исполнители:
- Римма И. Самойлова, Institute of Chemical Kinetics and Combustion RAS, Novosibirk, 630090 (проведение экспериментов ESEEM (electron spin echo envelop modulation), HYSCORE (hyperfine sublevel correlation), ENDOR (electron-nuclear double resonance), анализ данных).Список прилагаемых статей.
- Lai Lai Yap, Rimma I. Samoilova, Robert B. Gennis, and S. A. Dikanov, Characterization of the exchangeable Protons in the Immediate Vicinity of the Semiquinone Radical at the QH site of the Cytochrome bo3 from Escherichia coli. ,// J. of Biolog Chem. 2006 , 281, # 25, p 16879-16887.
- Lai Lai Yap, Rimma I. Samoilova, Robert B. Gennis, and Sergei A. Dikanov , Characterization of mutants that change the hydrogen bonding of the semiquinone radical at the QH site of the cytochrome bo3 from Escherichia coli ,J. of Biolog Chem. 2007, 282,# 12, p. 8777-8785.
- Myat T. Lin, Rimma I. Samoilova, Robert B. Gennis, and Sergei A. Dikanov , Identification of the Nitrogen Donor Hydrogen Bonded with the Semiquinone at the QH Site of the Cytochrome bo3 from Escherichia coli , Supporting Information. Identification of the nitrogen donor hydrogen bonded with the semiquinone at the QH site of the cytochrome bo3 from Escherichia coli, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130 (47), 15768-15769
- Lai Lai Yap, Myat T. Lin, Ouyang H., Rimma I. Samoilova, Dikanov S.A., Gennis R.B. , The quinone-binding sites of the cytochrome bo3 ubiquinol oxidase from Escherichia coli ,BBA-Bioenergetics, 2010, v. 1797 1924-1932