Конкурс научных работ 2012 года

Определение кинетических констант
методом восстановления флуоресценции
после фотообесцвечивания (FRAP) в неоднородных средах

А. В. Чернышев, Д. Ю. Орлова, В. П. Мальцев,
E. Bartova1, A. Harnicarova Horakova1, R. Uhlirova1, I. Raska5,6, G. Galiova1,
S. Kozubek1, G. Sustackova1, L. Stixova1, S. Legartova1, P. Matula1,4,
H.J. Gierman2, R. Versteeg3, R. Stoklasa4, R.N. Medvedev7.

1 Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Kralovopolska 135, CZ-612 65 Brno, Czech Republic.
2 Department of Developmental Biology, Stanford University, 279 Campus Drive, Stanford, California 94305, USA.
3 Department of Oncogenomics, Amsterdam Medical Center, University of Amsterdam, Meibergdreef 9, 1105 AZ Amsterdam, The Netherlands.
4 Faculty of Informatics, Masaryk University, Botanicka 68a, 602 00 Brno, Czech Republic.
5 Institute of Cellular Biology and Pathology, First Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Albertov 4, 12800 Prague, Czech Republic.
6 Department of Cell Biology, Institute of Physiology Academy of Sciences of the Czech Republic, Videnska 1083, 14220 Prague, Czech Republic.
7 Институт гидродинамики СО РАН, пр. ак. Лаврентьева 15, 630090, Новосибирск, Россия.

1. Общая формулировка научной проблемы и ее актуальность.

Метод FRAP основан на необратимом фотообесцвечивании флуоресцирующих молекул в небольшой области исследуемого образца при кратковременном интенсивном облучении и последующем наблюдении динамики восстановления флуоресценции данной области за счёт диффузии необесцвеченных молекул из соседних областей. FRAP эксперименты дают информацию о диффузионных свойствах исследуемых молекул и о константах скорости их ассоциации и диссоциации с реакционными центрами среды. В настоящее время наиболее интенсивно этот метод применяется и развивается в биологии для исследования динамики различных белков в ядрах живых клеток с использованием высокоразрешенной техники конфокальной микроскопии. Однако традиционный метод анализа FRAP исторически был создан корректно только для однородных сред. Прямое его применение в сильно неоднородных средах приводит к большим (иногда в несколько порядков!) ошибкам в определении кинетических параметров исследуемых процессов. Проблема корректного FRAP анализа неоднородных сред полностью не решена до сих пор. Причина этого заключается в том, что соответствующую данному методу модельную систему дифференциальных реакционно-диффузионных уравнений просто невозможно математически решить, если заранее не известно пространственное распределение реакционных центров (это относится, в частности, к ядрам живых клеток). Данная проблема становится все более актуальной в связи с развитием современных технологий на уровне одиночных живых клеток.

2. Конкретная решаемая в работе задача и ее значение.

Конкретная задача состоит в создании и экспериментальном подтверждении корректного метода FRAP анализа сильно неоднородных сред с неизвестным пространственным распределением реакционных центров для определения кинетических констант исследуемых процессов (коэффициента диффузии и констант скоростей ассоциации и диссоциации исследуемых молекул с реакционными центрами среды). Ее практическое значение заключается в формировании основ метода динамического FRAP анализа ядер живых клеток. Исследование в данной области представляется принципиально важным для биологии, экологии и медицины.

3. Используемый подход, его новизна и оригинальность.

Экспериментальное исследование осуществляется с применением современного конфокального микроскопа, позволяющего с высоким пространственным разрешением и большой скоростью измерять динамику изменения пространственного распределения интенсивности флуоресценции внутри живой клетки после фотообесцвечивания флуоресцентной GFP метки рассматриваемого белка. Полученные экспериментальные данные в виде последовательности изображений (видео-FRAP) обрабатываются оригинальным методом, идея которого заключается в том, что, в отличие от традиционного подхода, не ищется решение соответствующей математической модели в виде системы дифференциальных диффузионно-реакционных уравнений, а используются свойства самих этих уравнений. Для этого предлагается использовать два разных интегральных оператора, функционально зависящих от искомых кинетических констант (коэффициента диффузии и констант скорости ассоциации и диссоциации). Этими двумя интегральными операторами обрабатываются одни и те же экспериментальные видео-FRAP данные (в виде функций трех переменных) и в результате получаются две разные экспериментальные функции одного переменного (времени). Искомые кинетические параметры определяются методом нелинейной регрессии минимизируя среднеквадратичное отличие между этими двумя результирующими экспериментальными функциями. Метод не зависит от пространственного распределения реакционный центров в среде.

4. Полученные результаты и их значимость.

1) Разработан оригинальный метод FRAP анализа сильно неоднородных сред с неизвестным пространственным распределением реакционных центров для определения кинетических констант исследуемых процессов (коэффициента диффузии и констант скоростей ассоциации и диссоциации исследуемых молекул с реакционными центрами среды).

2) Данный метод был продемонстрирован на примере исследования диффузионной подвижности белков HP1 и c-Myc в ядрах живых клеток фибробластов мышиных эмбрионов.

5. Уровень полученных результатов в сравнении с мировым.

Развиваемые авторами оригинальные экспериментальные и теоретические методы находятся на уровне современных достижений в данной области мировой науки. Работы поддерживались международным грантом (Marie Curie PIRSES-GA-2010-269156-LCS), а также грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ "Научная школа НШ-387.2008.4" (руководитель С.В. Нетесов). Результаты работы докладывались авторами на международных конференциях. По теме работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах.

6. Вклад авторского коллектива.

Данная работа была выполнена в сотрудничестве научных коллективов нескольких институтов. Авторский коллектив ИХКГ СО РАН (А.В. Чернышев, Д.Ю. Орлова и В.П. Мальцев) внес основной вклад в постановку задачи и ее решения теоретическими и экспериментальными методами.

Список публикаций.
  1. E. Bartova, A. Harnicarova Horakova, R. Uhlirova, I. Raska, G. Galiova, D. Orlova, S. Kozubek. Structure and epigenetics of nucleoli in comparison with non-nucleolar compartments.// Journal of Histochemistry and Cytochemistry. Vol. 58(5), pp. 391 – 403, 2010.
  2. D. Yu. Orlova, E. Bartova, V. P. Maltsev, S. Kozubek, and A. V. Chernyshev. A nonfitting method using a spatial sine window transform for inhomogeneous effective-diffusion measurements by FRAP. // Biophysical Journal. Vol. 100(2), pp. 507 – 516, 2011.
  3. G. Sustackova, S. Kozubek, L. Stixova, S. Legartova, P. Matula, D. Orlova, E. Bartova. Acetylation-Dependent Nuclear Arrangement and Recruitment of BMI1 Protein to UV-Damaged Chromatin. // Journal of Cellular Physiology. Vol. 227, pp. 1838–1850, 2012.
  4. D.Yu. Orlova, L. Stixova, S. Kozubek, H.J. Gierman, G. Sustackova, A.V. Chernyshev, R.N. Medvedev, S. Legartova, R. Versteeg, P. Matula, R. Stoklasa, E. Bartova. Arrangement of nuclear structures is not transmitted through mitosis but is identical in sister cells. // Journal of Cellular Biochemistry, Vol. 113(11), pp. 3313–3329, 2012.


© 2012 ИХКГ СО РАН, г. Новосибирск