Конкурс научных работ 2013 года

Характеризация несферических частиц по светорассеянию

В.П.Мальцев, М.А.Юркин, А.Е.Москаленский, А.И.Конохова, А.В.Чернышев,
Д.И.Строкотов, В.М.Некрасов, Г.А.Цветовская¹, Е.Д.Чикова¹ А.А,Гелаш²

1. ИХБФМ СО РАН; 2. НГУ

1. Общая формулировка научной проблемы и ее актуальность.

Авторы представляют для участия в конкурсе цикл работ, в результате выполнения которых были созданы принципиально новые возможности измерения характеристик несферических частиц. Новые возможности связаны с использованием новых оригинальных подходов в решении обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц. Созданные методы обладают субдифракционной точностью в измерении морфологических характеристик частиц, которые могут моделироваться сплюснутыми или вытянутыми сфероидами, ограниченными цилиндрами. Созданные методы способны измерять малые отклонения в характеристиках биологических клеток несферической формы, связанные с особенностями функционирования их в организме, что потенциально способствует выявлению отклонений в функции клеток на ранних стадиях возникновения заболеваний.

2. Конкретная решаемая в работе задача и ее значение.

В предложенном цикле работ решена задача характеризации нескольких видов биологических частиц с использованием самых современных инструментальных и математических методов. В частности, впервые предоставлена медицинской диагностике полная характеризация тромбоцитов в нативном и активированном состояниях. Разработан метод характеризации палочкообразных бактерий крови по светорассеянию. Созданные методы могут быть использованы в медицинской клинической диагностике для повышения качества и достоверности диагноза различных заболеваний.

3. Используемый подход, его новизна и оригинальность.

Для исследования оптических свойств клеток крови были использованы самые современные методы исследования дисперсных систем с поштучным анализом элементов дисперсной фазы на высоких скоростях. Экспериментальной основой проведенных исследований является уникальный сканирующий проточный цитометр, позволяющий анализировать индивидуальные частицы в потоке по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Оригинальная технология сканирующей проточной цитометрии создана и развивается авторским коллективом, запатентована в России и в США (http://cyto.kinetics.nsc.ru/CYBILab/patents_rus.html). Для моделирования светорассеяния клетками сложной формы и структуры необходимо использовать наиболее универсальный теоретический подход, улучшая его пользовательские характеристики. В настоящем цикле работ использовался метод дискретных диполей (МДД) в новой высокопроизводительной реализации, созданной членами авторского коллектива. По производительности новая программная реализация метода занимает лидирующие позиции в мире. Так как не существует аналитического решения обратной задачи светорассеяния даже для однородной сферической частицы, то поиск методов решения этой задачи для несферических биологических частиц прошел через оригинальные апробации различных методов численного или приближенного решения условно-корректных задач.

4. Полученные результаты и их значимость.

Свойства тромбоцитов крови играют важную роль в возникновении большого количества заболеваний, в частности, тромбофлебита и гемофилии. Элементарным процессом, отвечающим за развитие данных заболеваний, является активация тромбоцитов. В рамках проведенной работы был создан метод, позволяющий количественно оценивать эффективность активации тромбоцитов человека. Метод основан на принудительной дозовой активации тромбоцитов и регистрации доли клеток, перешедших в активированное состояние. Так как при активации тромбоциты меняют форму, становясь более сферическими, метод основан на решении обратной задачи светорассеяния для клеток в форме сплюснутого сфероида с определением отношения осей. Решение обратной задачи базируется на методе узлового пространства (метод баз данных), для которого были разработаны алгоритмы вычисления точности определяемых характеристик. Достигнутая точность в измерении отношения осей сфероида позволила статистически достоверно разделить активированные и нативные тромбоциты [1]. Современные методы исследование штаммовой резистентности антибиотиков предполагают регистрацию увеличения числа бактерий в пробе, обработанной исследуемым антибиотиком. Для бактерий, обладающих длительным циклом деления, заметное увеличение численности может происходить за несколько дней, например, для палочки Коха. Существенного повышения эффективности лечения антибиотиками можно достичь с уменьшением времени анализа штаммовой резистентности. В данной работе [2] предложен метод измерения длины палочкообразных бактерий с высокой точностью. Средняя точность измерения длины бактерий кишечной палочки составила величину 130 нм, что в два раза ниже дифракционного предела. Метод базируется на измерении светорассеяния от одиночных бактерий и решении обратной задачи светорассеяния для цилиндров с крышками. Полученные результаты являются основой метода измерения штаммовой резистентности антибиотиков с регистрацией удлинения бактерий в процессе роста. Проводимая авторами систематическая и планомерная работа по созданию и развитию методов характеризации одиночных частиц по светорассеянию, была отмечена приглашением издательства Nova Science Publishers авторов для участия в формировании книги Flow Cytometry: Principles, Methodology and Applications [3]. Авторами подготовлена глава данной книги с представлением новых результатов и обобщением результатов, полученных в последнее время. В частности, представлен метод регистрации одиночного димера сферических частиц с определением шести характеристик: два размера и показателя преломления и два угла ориентации димера. Такое количество определяемых параметров является абсолютным рекордом для характеризации несферических частиц. Продемонстрирована работа метода идентификации частиц, имеющих сходные морфологические широкораспределенные характеристики, но отличающиеся по форме. Метод реализован при анализе плазмы крови, содержащей тромбоциты и микрочастицы крови. Возможности использования светорассеяния были представлены при анализе изменения формы эритроцитов крови во время их лизиса. В работе показано, что высокая точность измерения размеров ядра мононуклеарных клеток, позволяет выявлять долю клеток, ушедших в апоптоз, без использования флуоресцентных красителей и моноклональных антител.

5. Уровень полученных результатов в сравнении с мировым.

Авторский коллектив является единственным в мире, где проводятся систематические исследования оптических свойств биологических частиц с использованием светорассеяния. Лидирующий мировой уровень результатов, полученных в ходе выполнения работ, подтверждается одновременным использованием уникального экспериментального оборудования и новейших теоретических методов в моделировании и в обработке экспериментальных данных.

6. Вклад авторского коллектива.

Основная экспериментальная работа проводилась на цитометрах в ИХКГ СО РАН. На суперкомпьютере Новосибирского госуниверситета выполнялась большая часть теоретических расчетов по рассеянию палочкообразными бактериями и тромбоцитами. Вклад авторского коллектива в сделанные работы является определяющим.

Список публикаций.

1. Alexander E. Moskalensky; Maxim A. Yurkin; Anastasiya I. Konokhova; Dmitry I. Strokotov; Vyacheslav M. Nekrasov; Andrei V. Chernyshev; Galina A. Tsvetovskaya; Elena D. Chikova; Valeri P. Maltsev., Accurate measurement of volume and shape of resting and activated blood platelets from light scattering // J. Biomed. Opt. 2013. Vol. 18, № 1. P. 017001–017001. Импакт-фактор 2.881.
2. Anastasiya I. Konokhova, Andrey A. Gelash, Maxim A. Yurkin, Andrey V. Chernyshev, Valeri P. Maltsev, High-precision characterization of individual E. coli cell morphology by scanning flow cytometry Cytometry Part A. 2013. Vol. 83A, № 6. P. 568–575. Импакт-фактор 3.711.
3. Maltsev V.P., Chernyshev A.V., Strokotov D.I. Light-Scattering Flow Cytometry: Advanced Characterization of Individual Particle Morphology Flow Cytometry: Principles, Methodology and Applications / ed. Papandreou S. New York, NY, USA: Nova Science Publishers, 2013. P. 79–103.