Конкурс научных работ 2017 года

Цитометрия и биокинетика эритроцитов:
на пути к полной характеризации
самой многочисленной популяции клеток в крови

В.П. Мальцев, К.В. Гилев, Е.С. Ястребова, М.А. Юркин, А.В. Романов,
А.И. Конохова, А.В. Чернышев. Д.И. Строкотов,
Ю.С. Заикина1, Е.С. Серебренникова1, Г.А. Цветовская2, Л. Волков3,
Н.А. Кармадонова4, В.В. Ломиворотов4

1 Роддом ЦКБ СО РАН
2 ИХБиФМ СО РАН
3 Медицинский центр университета г. Квебек (Канада)
4 НМИЦ им. Мешалкина

1. Общая формулировка научной проблемы и ее актуальность.

Самая многочисленная популяция клеток крови человека – эритроциты – вызывала интерес в изучении их свойств с момента создания первого микроскопа. Однако, микроскопические изображения позволяли только фиксировать форму клеток, остальные характеристики были недоступны для измерения вплоть до появления приближения аномальной дифракции, которая позволила в некоторых случаях объяснить пространственное распределение интенсивности, рассеянной клетками. Сложность решения проблемы описания взаимодействия электромагнитной волны с нормальными эритроцитами заключалась в отсутствии адекватной математической модели формы клетки. Все имеющиеся модели были плохо обоснованы и удовлетворяли экспериментальным результатам в ограниченных случаях. Наряду с проблемой описания формы клетки, существовали трудности решения прямой задачи рассеяния, так как форма и размер эритроцита не позволяли использовать известные приближения. Естественно, что отсутствие возможности решать прямую задачу являлось непреодолимым препятствием в разработке решения обратной задачи с определением всех морфологических характеристик клеток. Тем более не представлялось возможным исследовать динамику изменения характеристик клеток в важных биологических процессах, где эритроциты играют определяющую роль. Представленный цикл работ является важным этапом на пути к полной характеризации эритроцитов по статическим и динамическим индексам. В данных работах 1) была предложена и прошла экспериментальную проверку математическая модель, которая описывает форму нормального эритроцита; 2) используя точное решение прямой задачи светорассеяния был разработан метод решения обратной задачи с определением всех статических характеристик эритроцитов в норме и при их сферизации в процессе лизиса; 3) получено решение прямой задачи биокинетики действия ионов магния на анионную проницаемость мембран клеток.

2. Конкретная решаемая в работе задача и ее значение.

Создание адекватного математического описания формы эритроцита – это первый этап в линейке задач характеризации клеток по статическим и динамическим индексам. Так как эритроцит является гомогенной частицей, то его форма, наряду с показателем преломления раствора гемоглобина, формируют оптическую модель клетки. Эта модель используется в решении прямой задачи светорассеяния, а именно, вычислении пространственного распределения интенсивности рассеяния плоской волны на клетке. Сопоставление рассчитанной и измеренной интенсивности рассеяния позволяет решить обратную задачу светорассеяния с определением статических характеристик эритроцитов.

Методов решения обратной задачи светорассеяния для эритроцитов не описано в литературе, так как клетка имеет сложную форму и размер, который требует использования точного решения прямой задачи светорассеяния. Оптическая модель эритроцита описывается пятью характеристиками, что предполагает использование методов глобальной оптимизации в решении обратной задачи. Такие методы используют итерационные процессы, которые в случае эритроцита не позволяют получить решение за разумное время. Необходимо преодолеть данное ограничение, так как именно по решению обратной задачи можно определить характеристики эритроцита.

Имея возможности определять характеристики эритроцитов с высокой точностью, можно приступить к исследованию динамических характеристик клеток, а именно, к решению прямой задачи биокинетики, например, создание молекулярно-кинетической модели лизиса эритроцитов. В процессе лизиса происходит изменение морфологии клеток и по измерению динамики этих изменений можно определить динамические характеристики клеточной популяции, например, проницаемость мембран эритроцитов. Значение проницаемости мембран является важнейшей функциональной характеристикой эритроцитов, обеспечивающих транспорт O2 – CO2 в организме. Процесс лизиса клеток проходит стадию сферизации, при которой клетки приобретают форму идеальной сферы. Решение обратной задачи светорассеяния в этом случае существенно упрощается, предоставляя возможность измерять характеристики сферической фракции в реальном времени.

3. Используемый подход, его новизна и оригинальность.

В решении всех задач цикла работ использовались уникальные инструментальные возможности оригинальной технологии – сканирующей проточной цитометрии в измерении оптических свойств элементов дисперсной фазы, эритроцитов крови человека, в режиме поштучного анализа. Предложена оригинальная формула для описания формы эритроциты в норме с использованием минимизации энергии поверхности замкнутого объема. Для решения прямой задачи светорассеяния на частицах сложной формы использовался оригинальный вычислительный пакет ADDA. Для определения статических характеристик эритроцитов в норме и в сферизованном состоянии были разработаны новые методы решения обратной задачи светорассеяния. Определение функциональных (динамических) характеристик клеточной популяции связано с решением прямой и обратной задач биокинетики. В случае эритроцитов задачи биокинетики относились к такому явлению, как лизис эритроцитов, в процессе которого клетки изменяют свою форму. Изменение формы регистрируется с помощью сканирующей проточной цитометрии и описывается молекулярно-кинетической моделью (прямая задача). Используя метод глобальной оптимизации и оригинальную молекулярно-кинетическую модель лизиса, определяются динамические характеристики эритроцитов (обратная задача). Все методы, используемые при определении функциональных характеристик клеток, являются оригинальными и обладают фундаментальной новизной.

4. Полученные результаты и их значимость.

Впервые в мире предложено математическое описание формы эритроцита в норме с использованием пяти характеристик, которое получило экспериментальное согласие при исследовании взаимодействия электромагнитной волны с реальными эритроцитами. При этом, используя передовое программное обеспечение в расчетах светорассеяния, была создана база данных индикатрис эритроцитов с характеристиками, которые перекрывают их возможные физические границы в реальных условиях. База данных использовалась при определении всех пяти статических характеристик одиночных клеток. Созданное методическое обеспечение можно использовать при расширенном анализе клеток крови в гематологических исследованиях. Вместо 7 параметров эритроцитов, которые определяют на самых лучших гематологических анализаторах, предложенное методическое обеспечение позволяет характеризовать клетки по 35 параметрам, что существенно повышает вероятность обнаружения заболевания при отклонении от норм одного из них.

Разработана молекулярно-кинетическая модель лизиса эритроцитов в присутствии ионов магния. Магнийсодержащие препараты широко используются в медицине. Однако, до настоящего времени дозировка этих препаратов могла осуществляться только в статистически определенном режиме. С использованием созданной молекулярно-кинетической модели дозировку препаратов можно рассчитать для получения нужного эффекта, например, увеличения пропускной способности анионных обменников на мембране эритроцитов. Авторы продемонстрировали возможности нового методического обеспечения при оценке риска преждевременных родов пациенток родильного дома ЦКБ СО РАН. Для увеличения количества динамических характеристик эритроцитов и повышения их точности авторы разработали спектральный метод определения размера и концентрации гемоглобина сферизованных эритроцитов, фракция которых появляется и исчезает в процессе лизиса.

5. Уровень полученных результатов в сравнении с мировым.

Разработанные методы обладают мировой новизной в инструментальном, теоретическом и экспериментальном планах при статической и динамической характеризации эритроцитов человека. Достигнуты рекордные результаты по полноте характеризации самой многочисленной популяции клеток в крови. Результаты докладывались на ведущих международных конференциях. Работа поддерживается грантами РФФИ и РНФ.

6. Вклад авторского коллектива.

Вклад авторского коллектива из ИХКГ является определяющим. Вклад сотрудников медицинских и биологических организаций состоял в предоставлении клеточного материала с информацией о состоянии здоровья доноров крови.

Список публикаций.
  1. Chernyshova E.S. et al. , Influence of magnesium sulfate on HCO3/Cl transmembrane exchange rate in human erythrocytes, Journal of Theoretical Biology. 2016. Vol. 393. P. 194–202.
  2. Gilev K.V. et al., Mature red blood cells: from optical model to inverse light-scattering problem, Biomedical Optics Express. 2016. Vol. 7, № 4. P. 1305.
  3. Gilev K.V. et al., Advanced consumable-free morphological analysis of intact red blood cells by a compact scanning flow cytometer, Cytometry. 2017. Vol. 91, № 9. P. 867–873.
  4. Romanov A.V. et al., Spectral solution of the inverse Mie problem , Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer. 2017. Vol. 200. P. 280–294.
ПРИЛОЖЕНИЕ

Информационное приложение

1. Chernyshova E.S. et al. Influence of magnesium sulfate on HCO3/Cl transmembrane exchange rate in human erythrocytes // Journal of Theoretical Biology. 2016. Vol. 393. P. 194–202.
5-IF* 2.26 MATHEMATICAL & COMPUTATIONAL BIOLOGY** 4.38 Σ 6.64
2. Gilev K.V. et al. Mature red blood cells: from optical model to inverse light-scattering problem // Biomedical Optics Express. 2016. Vol. 7, № 4. P. 1305.
5-IF 3.54 OPTICS 5.75 Σ 9.29
3. Gilev K.V. et al. Advanced consumable-free morphological analysis of intact red blood cells by a compact scanning flow cytometer // Cytometry. 2017. Vol. 91, № 9. P. 867–873.
5-IF 3.13 BIOCHEMICAL RESEARCH METHODS 2.69 Σ 5.82
4. Romanov A.V. et al. Spectral solution of the inverse Mie problem // Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer. 2017. Vol. 200. P. 280–294.
5-IF 2.64 SPECTROSCOPY 3.00 Σ 5.64
Σ27.39

* журнальный критерий. Импакт-фактор журнала за последние 5 лет.

** категориальный критерий. Отношение общего количества журналов в данной категории к позиции, занимаемой конкретным журналом.

Примечание.

  1. Журнальный и категориальный критерии можно взять в базе WoS, нажав на поле «Journal Citation Reports».
  2. Если публикация не представлена в WoS, то журнальный критерии принимается равным 0.25, а категориальный – 1 (единица).


© 2017 ИХКГ СО РАН, г. Новосибирск