Исследование генерации активированных кислородных метаболитов и состояния основных антиоксидантов в гемолимфе насекомых в процессе иммунного ответа.

И. А. Слепнева, A. Д. Рязанова, Д. А. Комаров, Е. А. Гризанова1, И. М. Дубовский1 и В. В. Глупов1
1Институт систематики и экологии животных СО РАН, 630091,
Российская Федерация, Новосибирск, Фрунзе, 11

Отличительной особенностью иммунитета насекомых является инкапсуляция чужеродного организма. Образование капсулы происходит в процессе меланизации, ключевым ферментом которого является фенолоксидаза. Фенолоксидаза катализирует окисление тирозина и дифенолов, в частности дигидроксифенилаланин (ДОФА), до хинонов, которые полимеризуюясь образуют меланиновую капсулу вокруг патогена. Химические процессы, приводящие к гибели патогена, исследованы недостаточно. Предполагается, что в ходе процесса инкапсуляции может происходить образование активированных кислородных метаболитов (АКМ), являющихся цитотоксичными молекулами. Ранее нами было показано, что как в модельной системе - при окислении ДОФА фенолоксидазой, а также во время меланогенеза в гемолимфе личинок Galleria mellonella, происходит образование высокореакционного ДОФА-семихинонового радикала (I. Slepneva, D. Komarov, V. Glupov, V. Serebrov, and V. Khramtsov, 2003. Biochem. Biophys. Res. Com., 300, 188-91). Что касается супероксидного радикала, то имеющиеся в литературе и полученные нами данные (D. Komarov, I. Slepneva, V. Glupov, and V. Khramtsov, Free Rad. Res. 2005; 39(8), 853-8) не позволяют сделать однозначный вывод об его участии в цитотоксических реакциях в гемолимфе насекомых. Однако в любом случае реакции восстановления и дисмутации O2• приведут к образованию перекиси водорода и, возможно, гидроксильного радикала через реакцию Фентона. В настоящей работе нами была зарегистрирована в гемолимфе насекомых повышенная генерация перекиси водорода и других АКМ в ответ на инъекцию личинкам G. mellonella убитых бактериальных клеток [1]. Используя метод спиновых ловушек и спектроскопию ЭПР, было показано образование ОН•-радикала в лимфе насекомых (личинки Galleria mellonella) в процессе меланогенеза [2].

С помощью метода ЭПР было исследовано образование активированных кислородных метаболитов и изменение их стационарной концентрации в лимфе насекомых в течение суток при моделировании процесса иммунного ответа введением нейлоновых имплантантов [3]. Установлено, что уже через 15 мин после прокола кутикулы имплантантом происходит образование капсулы на его поверхности. При исследовании генерации АКМ в лимфе насекомых по скорости окисления «спиновой ловушки» СР-Н было зарегистрировано 2-х кратное увеличение генерации АКМ через 15-30 минут после внедрения имплантанта. Анализ образования перекиси водорода в лимфе при развитии инкапсуляции показал схожие тенденции. Полученные нами данные подтвердили, что образование капсулы и ее меланизация сопровождается образованием АКМ. Кроме того, отмеченный выброс АКМ в лимфу подтверждает гипотезу об их участии в уничтожении патогенов, проникших в гемоцель.

В организме насекомых, как и у многих других животных, существует антиоксидантный комплекс, действие которого направленно на элиминацию АКМ. Значение антиоксидантов в процессах меланизации и инкапсуляции инородных объектов слабо изучено. Большинство работ, описывающих роль антиоксидантов при меланогенезе, проводились in vitro с использование экзогенных (выделенных) ферментов и позволяют лишь смоделировать процессы, происходящие в организме насекомого. В связи с этим нами было исследовано изменение количества основных антиоксидантов, аскорбата и тиолов, с помощью метода ЭПР спиновых зондов в лимфе личинок большой вощиной моли Galleria mellonella при развитии процесса инкапсуляции нейлоновых имплантантов.

Полученные в работе результаты позволяют предположить уникальный механизм уничтожения патогенного организма посредством локальной генерации АКМ [4].

5. Уровень полученных результатов в сравнении с мировым.
Работа поддержана грантом РФФИ (09-04-01582) и интеграционным проектом СО РАН (№ 46). Докладывалась на международных конференциях:
  1. ENTO’ 09: National science meeting & International symposium of the royal entomological society. Sheffield, 15-17 July 2009 - стендовый
  2. ENTO’ 09: National science meeting & International symposium of the royal entomological society. Sheffield, 15-17 July 2009 - стендовый
  3. 10th International Summer School on biophysics "Supramolecular structure and function", Rovinj, Croatia, 2009 - стендовый
  4. 2nd International Conference RAHMS: Recent advantages in health and medical sciences, Paphos, Cyprus, July 8-12, 2010 – стендовый
  5. Royal Entomological Society. National Science Meeting and International Symposium, England, July 2010 – устный
  6. IX European congress of entomology, Budapest, Hungary, August 2010 - устный
6. Вклад авторского коллектива.

Вклад авторского коллектива из ИХКиГ: 80%.

Список прилагаемых статей.
  1. Комаров Д.А., Слепнева И.А.,. Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Храмцов В.В., Глупов В.В. , Generation of Superoxide Radical and Hydrogen Peroxide in Insect Hemolymph in the Course of Immune Response, 2006. Доклады академии наук, т. 411, № 3, с. 420-423.
  2. D. Komarov, A. Ryazanova, I. Slepneva, V. Khramtsov, I. Dubovskiy, and V. Glupov, Pathogen-Targeted Hydroxyl Radical Generation during Melanization in Insect Hemolymph: EPR Study of a Probable Cytotoxicity Mechanism, 2009. Appl. Magn. Reson., 35, 495-501.
  3. Дубовский И.М., Гризанова Е.В., Черткова Е.А., Слепнева И.А., Комаров Д.А., Воронцова Я.Л., Глупов В.В., Генерация активированных кислородных метаболитов и активность антиоксидантов в гемолимфе личинок Calleria Mellonella ( Lepidoptera: Piralidae) при развитии процесса инкапсуляции, 2010. Журнал эволюционной биохимии и физиологии, т. 40, № 1, с. 28-34.
  4. Глупов В.В., Слепнева И.А., Дубовский И.М, Генерация активированных кислородных метаболитов при формировании имунного ответа у членистоногих, 2009. Труды Зоологического института РАН, т. 313, № 3, с. 297-307.